나노바디 (Nanobody)리뷰 (2) 생물/화학적 특징

https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-063011-092449

나노바디 연구를 위한 전반적인 구조 및 기능, 생물학적 특성들과 applications들에 대한 reivew 페이퍼로 25년 2월 기준 citation을 2400회를 기록중인 Nanobody에 대한 바이블같은 리뷰 논문이다. 읽어가며 차근차근 개념을 정리하자. 나도 매번 Ab, Nb 구조들은 약어로 나타내는 통에 하도 헷갈려서 안되겠어서 정리하는 겸사 읽어본다.

https://biomadscientist.tistory.com/160

나노바디 (Nanobody)리뷰 (1) 구조적 특징

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3. BIOCHEMICAL PROPERTIES OF NANOBODIES

3.1. Identification of Antigen-Specific Nanobodies

Antigen에 specific한 Nbs를 얻기 위해서는 크게 두가지 방법을 사용한다. 하나는 실제 동물을 이용한 면역화(immunization) 방법을 통한 selection인데 이 방법은 실제로 동물에 항원을 찔러넣고 거기에 특이적으로 결합하는 Antibody를 생산하는 B-cell을 얻는 방법으로 생물학적으로 완벽한 메커니즘을 갖는 '생물' 그자체를 이용해 항체를 생산하므로 상당히 항체로써 기능하는데 유리한 생물학적 특성을 만족하는 그야말로 자연 그대로의 항체를 얻을 수 있다는 최대의 단점이 있지만 반면 직접 낙타류나 라마류의 동물에 항원을 주사해야 하기 때문에 윤리적인 허가나 비용적인 측면에서 일반적인 규모의 실험실에서 절대로 쉽게 진행될 수 없는 실험이라 이상론에 그치는 방법일 뿐이다.

실험실에서 가장 선호하는 방법은 Phage display를 통한 synthetic Nbs를 얻는 방법이다. 아주 간단하게 이야기하자면 bateriophage의 표면에 Nbs를 발현하도록 하고, Target Ag을 코팅한 플레이트에서 여러번 panning과정을 거친 뒤에도 남아있는 phage만을 선별하고 ELISA를 진행해 Nbs의 서열을 알아낸 뒤 해당 Nbs 서열을 사용한다는 실험이다.

논문 저자들은 이 Phage display 방법을 이용하면 target Ag에 대해서 1년 정도의 시간 내에 훌륭한 Nbs를 얻어낼 수 있다고 이야기하고 있지만 내가 실험방에서 Phage display를 하는걸 보면 실험도 어렵고 절대 그렇게 간단하고 쉽게 얻어지지 않았다. 

 

3.2. Affinity Parameters of Nbs

보통 Nbs들의 Affinity value는 결합 속도 상수(K_on)와 해리 속도 상수(K_off)라는 지표로 측정된다고 한다. 그리고 보통 단백질의 affinity를 나타내는데 사용되는 Kd(Dissociation constant)값은 또 다음과 같이 나타낼 수 있다고 한다.

보통 Nbs들은 Affinity가 상당히 높은 nM 단위인 측면에 속하는 경우가 많다고 한다. 그럼에도 불구하고 여러 in vitro 방법을 통해서 나노바디의 affinity를 further maturation하는 실험들 및 mutation을 이용해서 더 좋은 affinity를 갖는 Nbs 서열을 찾기 위한 알고리즘적인 방법들도 연구되었다고 한다. (Kinetic and affinity predictions of a protein-protein interaction using multivariate experimental design, 2002)

 

3.3. Expression of Recombinant Nbs

3.1.절의 Phage display를 다시 설명하는 부분이라 생략한다.

 

3.4. Stability of Nbs ~ 3.5. Nanobodies Are Nonimmunogenic

이 부분부터는 그냥 Nbs들의 특성 내용을 쭉 열거한 부분이라 그냥 ChatGPT요약본으로 업로드한다.

Stability of Nanobodies

Nanobody(Nb)는 높은 안정성을 가지며 다양한 환경에서도 구조적 무결성을 유지할 수 있음.

• 저장 안정성: Nbs는 4°C에서 몇 달간, -20°C에서 장기 보관 시에도 항원 결합 능력을 유지함.
• 내열성: 일반적으로 60-80°C에서 변성되며, 일부 Nbs는 90°C 이상의 고온에서도 안정적임.
• 화학적 안정성: 2.3-3.3M의 guanidinium 환경에서도 구조를 유지함.
• 소화효소 저항성: 특정 disulfide bond를 도입하면 pepsin 및 chymotrypsin 같은 소화효소에 대한 저항성이 증가하며, 이는 경구 투여 가능성을 높임.
• 환경 내성: detergents, denaturants 및 높은 urea 농도에서도 기능을 유지하는 Nbs가 존재함.
• 구조적 최적화: Cys54와 Cys78을 이용한 추가 disulfide bond 형성 시, 단백질 분해 저항성이 증가함.
• 재형성 가능성: denaturation 이후도 원래 상태로 회복 가능하며, 이는 산업적, 제약적 응용에 유리함.

Nanobodies Are Nonimmunogenic

Nbs는 면역 반응을 유발하지 않는 특성을 가지며, 인체 내에서 안전하게 사용될 가능성이 큼.

• 면역원성 없음: 실험적으로 마우스 및 인간에서 Nb 투여 시 면역 반응이 유도되지 않음.
• 높은 인간 유사성: 인간 VH 도메인과 높은 서열 유사성을 가지며, 인간화(humanization)를 통해 면역원성을 더욱 낮출 수 있음.
• 의약적 응용 가능성: 안정적인 약물 전달체로서 활용 가능하며, 면역 반응을 최소화한 치료제 개발이 가능함.

 

3.6. Recognition of Unique Epitopes by Nanobodies and Multivalent and/or Multispecific Constructs

독특한 에피톱 인식 (Recognition of Unique Epitopes)

• Nanobody(Nb)의 특이적 항원 결합: 일반 항체와 달리, Nbs는 볼록한(paratope convex) 구조를 형성하여, 단백질 표면의 오목한(concave) 영역, 효소 활성 부위, 수용체 결합 부위와 강한 상호작용을 할 수 있음.
• 효소 활성 조절 가능: 많은 Nbs가 효소의 촉매 작용을 억제하거나 (inhibition), 경우에 따라서는 활성화 (activation) 시킬 수도 있음.
• 알로스테릭 조절 가능: 특정 Nbs는 효소의 알로스테릭 부위(allosteric site)에 결합하여 활성 상태를 변화시킬 수도 있음.

Multivalent (다중 결합) 및 Multispecific (다중 특이성) Nanobody 구성

Nbs는 다중 결합(multivalent) 및 다중 특이성(multispecific) 형식으로 조합될 수 있으며, 이를 통해 기능성을 강화할 수 있음.

• Bivalent (이가 결합형) Nanobody: 같은 항원을 인식하는 두 개의 Nb를 연결하여 결합력(affinity)을 증가시킴.
• Biparatopic (다중 에피톱 인식) Nanobody: 같은 항원 내 **서로 다른 두 개의 에피톱(epitope)**을 동시에 인식하여, 결합 강도를 증가시키고 항원과의 강력한 상호작용을 유도.
• Bispecific (이중 특이성) Nanobody: 서로 다른 두 항원을 동시에 결합하여, 면역세포 활성화, 종양 치료, 약물 전달 등에 응용 가능.
• Multimerization (다중화): Nbs를 leucine zipper motif 또는 verotoxin pentamerizing motif와 결합시켜 다중화(multimerization)하여, 강한 항원 결합력을 갖는 고효율 치료제로 활용 가능.
• Chimeric HCAbs (혼합형 HCAbs): Nb를 인간/마우스 IgG의 Fc 도메인과 결합하여, 긴 혈중 반감기(long half-life)와 높은 안정성을 유지하는 치료용 항체 제작이 가능.

 

4. APPLICATIONS WITH Nbs

이 부분도 그냥 언급된 기술들 중 내 연구에 적용 가능할법한 몇몇 기술들만 정리해두자

[연구기반]

• Nanobody의 작은 convex 형태의 구조가 항원 표면의 움푹 들어간 틈 (clefts) 사이를 target으로 하여 interaction하는 연구의 전반적인 아이디어 가능
• His6 tagged nanobody generation (이건 그냥 정제하기 쉬워서)
• GFP tagged nanobody generation (GFP를 통해 injection된 nanobody가 어디로 갔는지, 원하는 tissue에서 발견되는지 확인이 가능하다)
• F-Box domain tagged nanobody generation (Poly-ubiquitination mediated proteasom degradation) 

 

[진단기반]

 

• 다양한 포맷에서의 적용: Nbs는 효소면역법(ELISA), 면역형광법, 및 이미징 기술에서 높은 성능을 보여줍니다. 특히, 비침습적 이미징을 위한 방사성 라벨링이 가능해 환자 친화적인 진단 솔루션을 제공함 
• 특히 방사성동위원소 tagging하여 MRI등에서 사용할 때 좋은 특성으로 Affinity와 specificity는 높아서 원하는 tissue에 바로 달라붙고, half-life는 짧아서 blood에 남아있는 것들은 빠르게 제거되는 특성을 이용해서 이미징에 유리한 진단용 시약 개발 가능

 

[Therapeutics 기반]

 

• 높은 안정성: Nbs는 극한의 조건에서도 구조를 유지하며, 경구 투여나 흡입 투여와 같은 환자 친화적인 방식으로도 활용 가능
• 다중 특이성과 다중 결합 가능성: 여러 항원에 동시에 결합하거나, 한 항원의 다양한 부위에 강하게 결합할 수 있어, 효율적인 치료제 설계가 가능
• 면역원성 감소: Nbs는 기존 단백질 치료제보다 면역 반응을 유발할 가능성이 낮아, 인체에서 안전하게 사용될 수 있음
• 독특한 표적 공략: Nbs는 효소 활성 부위나 수용체 결합 틈과 같은 기존 항체로는 공략하기 어려운 표적에도 접근할 수 있음
• 무엇보다 Boold-Brain-Barrier 투과능력이 있어서 Brain disease 관련 치료제 개발이 가능하다는 점을 꼭 이용하자

 

 

읽다보니 structure 부분에선 볼만한게 많이 있었는데 생물화학적 관점 분야에서는 너무 장점만 소개하고 있는데다가 2013년도 거의 12년전 논문이라 조금 더 최신 논문을 볼 필요가 있겠다는 생각이 들어서 그냥 ChatGPT 이용해서 대강 정리하고 내 연구에 필요한 부분만 정리하였다. 다음 논문은 조금 더 최신의 Nbs review 논문을 찾아보려고 한다.