나노바디 생산 및 디자인 가이드

 

A guide to generation and design of nanobodies.pdf

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이번에 읽어볼 나노바디 리뷰 논문이다. 2월달 내내 관련된 리뷰 페이퍼와 Antibody, Nanobody 생성모델에 관련된 top tier conference/ journal의 논문들을 가능한 많이 읽어볼 생각이다. (라고하는 지금 이 시점에서 당장 다음주 내내 일본으로 여행을 다녀올 예정인 나..)

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1. Introduction

Antibody는 참 좋은 tool로 사용된다. 특히 연구분야, 진단분야, 치료제분야에서 사용되며 특히 Target Ag에 상당히 specific하고 강하게 binding한다는 특성 때문에 선호된다. 

그런데 문제가, 아무래도 conventional Ab (Ab)는 Heavy Chain (HC)와 Light Chain (LC)으로 구성되고 단백질 자체가 박테리아등에서 생산하기에는 약간 무리가 있는 사이즈 (150KDa)인점, 15개의 disulfide bond등이 들어가 구조 자체가 redox condition적으로 불안정하여 공장에서 상업적으로 생산하기에는 문제가 조금 있단다.

https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/polyclonal-antibody

그래서 LC와 HC의 variable domain만 1개씩 가져와서 synthetic linker를 이용해서 사이즈를 작게 만들되 Ag interaction은 가능하도록 설계한 single chain variable Fragment (scFv)를 만들었단다. scFv는 Ab에 비해서 여러 장점이 있는데 genetic engineering을 이용해서 (cloning등의 기술) 박테리아에서 생산성이 좋아져서 경제적으로 훨씬 저비용을 들여서 생산이 가능해진다는 점, phage display등의 기술을 이용해서 target Ag에 specific하게 interaction하는 scFv를 선별하기 더 쉬워진다는 점 등이 있다고 한다.

그러나, scFv는 치명적인 단점으로 서로에 대한 dimerization이 발생하거나 aggregation이 심각해서 어떤 목적을 가지고 사용하기에 좋지 못한 성능을 보인다는 단점이 있다고 한다. Aggregation이 심한 분자의 경우는 당연히 사용이 불가능하니까 앞으로 연구함에 있어서 scFv 생성할 생각은 집어 치우도록 하자.

실제로 연구자들도 scFv의 이런 특성 때문에 연구를 집어치우고 single domain의 Human VH 기반의 protein-scaffold를 연구했다고 한다. 대표적인 성공예시로 다음 세가지를 들고 있다 Affibody, Adnectins, knottins (2007, Alternative non-antibody scaffolds for molecular recognition)

근데 위에서 언급된 Human VH 기반의 대체분자들의 장점을 아우르면서도 추가적인 장점을 가지고 있는것이 바로 Camelidae류에서 생산되는 VHH(또는 Nanobody)라고 한다. 또는 상어류에서 나타나는 Variable regions of New Antigen Receptor (V-NAR) 역시 VHH와 상당히 많은 특성을 공유한다고 한다. 예를들어 둘 다 Ag의 움푹 파여있거나 굴곡져있는 표면을 target으로 해서 강하게 binding한다는 점이나, 보통의 Ab라면 변성되는 단백질에 좋지 못한 환경들에 대한 내성이 강하다는 장점들을 공유한다는 점, CDR loop내의 disulfide bond 구조등을 공유한다. 

다만, VHH가 Human의 VH 구조에 훨씬 유사한 형태를 띄고 V-NAR와는 약간 다른 모습을 가지기 때문에 연구 가치로는 아무래도 V-NAR는 연구가 잘 안되고 있고 VHH에 대한 연구가 많이 진행되고 있다고 한다. 

기존에는 scFvs가 Nbs보다 훨씬 많이 각광받았고 Nbs는 별로 주류가 되지 못했지만 최근 연구 동향을 살펴보면 이제 scFv보다 오히려 Nbs의 연구가 훨씬 성장동력이 있는 모습을 보이고 있다고 한다. (https://doi.org/10.3390/antib8010016) (이 논문은 나도 나중에 논문 쓸때 reference로 참조하기 딱 좋은 내용이다.)

지금부터 Nbs에 관련된 어떤 연구들이 진행되고 있는지를 살펴보도록 하자.

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2. Generation of nanobody libraries

Immune, synthetic and naive libraries

소제목처럼 크게 3가지 방법의 nanobody libraries를 얻는 방법들이 있는데 내가 연구할 컴퓨터 공학적인 방법은 immune과 naive와 연계하기는 쉽지 않다. 따라서 두 방법론들에 대해서는 언급하지 않고 Synthetic library를 이용한 Nbs generation에 대해서만 포스팅한다.

Synthetic Nbs library합성할 때에 CDR1과 CDR2에는 다음과 같은 제약사항을 두는 것이 일반적이라고 한다.

1. Cystein, Proline, Methionine은 들어가지 않는다. (낙타의 VHH는 CDR1과 CDR3의 Cys-Cys disulfide bond가 필수적인 요소라고 했지만 Synthetic library에서는 그렇지 않은가보다. 이부분은 조금 더 찾아봐야 할 것 같다.)
2. Surface hydrophobicity를 감소시키기 위해서 Leu와 IsoLeu는 비율을 낮춘다. (어느정도로 낮추는지도 찾아보자)
3. Alanine, Serine, Threonine, Tyrosine, Asparagine들은 다른 AA보다 더 frequently 발생하도록 유도한다.

CDR3의 경우는 length 자체가 상당히 variable한 특성을 가지므로 variable length를 가지도록 library를 제작한다는데 더 자세한 내용은 의외로 나와있지 않다. 이부분은 내가 추가로 더 찾아봐야겠다. 

library를 제작할때는 stop codon 형성 문제를 방지하기 위해서 3 codon block 단위로 애초에 만들어서 합성한다고 한다. (NNK)형태로 만든다고 보통 이야기하는걸로 알고있다. 생성모델 연구에서는 보통 단백질 서열 단위로 연구되기 때문에 크게 고려할 사항은 아니라고 생각된다.

Retrieval of target-specific Nbs

해당 내용은 phage display에 대한 실험 내용인데, 나는 대부분 이미 알고 있는 내용이므로 생략한다. 그냥 chatGPT에게 요약만 부탁했다. 

Phage Display를 이용한 Nanobody 선별의 개요

Phage display는 항원-항체 결합 특성을 이용해 항원에 특이적으로 결합하는 Nanobody(Nb)를 회수하는 기술입니다. 이 기술은 기존 항체 라이브러리 및 Nanobody 라이브러리에서 특정 항원을 인식하는 결합체를 식별하기 위해 광범위하게 사용됩니다.

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1. Phage Display 기술의 원리

• 라이브러리 제작
  Phage display에서 가장 먼저 해야 할 일은 Nanobody 라이브러리를 만드는 것입니다. 낙타과 동물(예: 알파카 또는 라마)을 면역시켜 항체 반응을 유도한 후, B세포에서 mRNA를 추출하여 항체의 가변 영역(VH) 및 결합 영역(VHH)을 분리합니다.
• 여기에서 생성된 유전자는 파지의 외부 단백질(주로 pIII)에 융합됩니다. 이를 통해 Nanobody가 파지 표면에 발현되며, 표적 항원과의 결합을 시험할 수 있습니다.

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2. 파지 디스플레이 라이브러리 제작

• 면역 기반 라이브러리
  특정 항원으로 면역 반응을 유도한 후, 이 항원에 특이적으로 결합할 가능성이 높은 Nanobody를 포함하는 라이브러리를 만듭니다. 이 방법은 고친화성(high-affinity)의 Nanobody를 높은 성공률로 선별할 수 있습니다.
• Naive 또는 합성 라이브러리
  면역 반응 없이 다양한 Nanobody 서열을 무작위로 생성한 라이브러리를 사용합니다. 이 방법은 특정 항원에 결합하는 Nanobody를 찾는 데 시간이 더 걸리며, 면역 기반 라이브러리보다 성공률이 낮을 수 있습니다.

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3. 파닝(Panning) 과정: 항원 특이적 파지의 선별

Phage display의 핵심은 **파닝(panning)**입니다. 이 과정은 항원이 코팅된 웰에서 시작됩니다.

1. 항원 코팅
   플라스틱 웰이나 비드에 항원을 코팅하여 표적을 준비합니다.
2. 파지 노출
   항원이 코팅된 표면에 파지 라이브러리를 추가합니다. 각 파지의 외부 단백질에 발현된 Nanobody가 항원과 결합할 수 있습니다.
3. 세척
   항원에 약하게 결합한 파지는 강력한 세척 과정을 통해 제거합니다. 이를 통해 높은 친화성을 가진 Nanobody만 남게 됩니다.
4. 결합된 파지 회수
   남아 있는 결합된 파지는 산성 용액 등을 이용해 항원으로부터 분리한 뒤, 감염 가능한 상태로 다시 복구하여 다음 단계로 넘어갑니다.
5. 결합력 강화
   각 라운드에서 항원 농도를 점진적으로 감소시키거나 세척 조건을 더 엄격히 하여 높은 친화성의 Nanobody를 선별합니다. 이 과정을 2~4번 반복하여 최적의 결합체를 얻습니다.

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4. M13 파지 시스템의 역할

Phage display에서 M13 파지는 주로 사용되는 매개체입니다. 이 파지는 DNA 삽입이 쉽고, 항체 결합 도메인을 안정적으로 발현할 수 있는 특징이 있습니다. 또한, phagemid 벡터 시스템은 파지 라이브러리를 제작하는 데 핵심적인 역할을 합니다.

• Helper Phage
  파지 감염 후 M13 helper phage를 이용하여 표면에 Nanobody를 발현하는 파지를 대량 생산합니다.
• 유전자 융합
  Nanobody 유전자는 파지의 pIII 단백질에 융합되며, 이는 표면에 발현된 Nanobody가 항원과 직접 결합하도록 합니다.

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5. 최종 Nanobody 선별

• 선별된 파지에서 Nanobody 유전자를 추출하여 서열 분석 및 발현을 진행합니다.
• 고순도 Nanobody는 이후 효소면역법(ELISA) 등을 통해 항원 결합력 및 특이성을 확인합니다.

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Phage Display의 장점

1. 고효율
   높은 친화성을 가진 Nanobody를 신속히 선별할 수 있습니다.
2. 다양한 표적 적용 가능
   유연한 항원(단백질, 작은 분자, 세포)에도 적용 가능하며, 효소 활성 부위와 같은 특수한 표적에 적합합니다.
3. 시간 및 비용 효율성
   1~2주 내로 고품질 Nanobody를 얻을 수 있어 실험 효율이 높습니다.

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3. Engineering of the lead Nb to fit the application

3.1. Humanisation of Nbs

이부분 잘 공부해야한다. Nbs를 선별하는 과정 이후에도 다음과 같은 내용들을 지켜줘야 immunogenicity에 문제가 없는 Nbs를 얻을 가능성을 높일 수 있다고 한다.

VHH hallmark amino acids 서열은 유지한다 : 특히 대부분의 Nbs는 FR2의  F/Y42, G/Q49, R50, G52는 conserved되어있다 (General strategy to humanize a camelid single-domain antibody and identification of a universal humanized nanobody scaffold, 2007)

3.2. Genetic Fusion with Nbs

상업적으로 이용하기위해서 purification하거나 detection research를 진행하기 위해서 보통 Nbs에는 his6-tag 또는 c-myc tag등 다양한 tagging flag들이 사용된다. 

또 Nbs는 N-ter쪽에 나와있고, 다른 기능을 가진 단백질을 C-ter쪽에 genetically 추가로 달아줘서 synthetic protein을 합성하는 연구도 상당히 많이 이용된다. 이렇게 서로 달아놓기 위해서는 보통 linker라는 얇은 단백질 가닥을 추가하는 경우가 많은데 (Gly4Ser)3 등의 구조나 protease에 의한 분해를 막기 위해서 human IgA의 hinge 부분의 구조를 많이 사용한다고 한다. (상당히 좋은 정보같음 나중에 나도 이런 연구를 할 생각이기 때문에) (Engineering camel single-domain antibodies and immobilization chemistry for human prostate-specific antigen sensing)

똑같은 Nbs 구조를 linker를 이용해서 2개를 이어 붙여놓은 구조도 많이 사용된다. 이것은 avidity가 증가해서 여러 Ag을 붙잡을 수 있도록 해서 dose에 비해 target Ag에 대한 interaction 비율을 높일 수 있는 대표적인 방법이다. 다만, 어림짐작이지만 분명히 그 linker때문에 서로 꼬여버린다는 둥(aggregation 증가) 여러 문제도 분명 함께 동반될 것이다.

동일하지 않은 Nbs 구조를 2개 연결하면 Bi-specific이 될것이다. 이것도 장점이 있지만 단점도 분명 있을 것이다. 좋은 논문이 되기 위해서는 Nbs의 이런 variants 구조를 많이 공부하고, 그것들까지 reasonable하게 생성할 수 있는 모델이어야 한다고 생각한다. 

또는 대안으로 사용하는 방법이, 2개의 Nbs를 붙여놓되, 하나는 serum albumin을 targeting하는 Nbs를 붙여서 bllod circulation time (Half-life)를 증가시키는 방법도 있다고 한다. 3가지 논문을 ref로 달아놓았는데 가장 최근 2019년 논문만 일단 적어둔다. 이내용은 나중에 참고를 해볼법하다. (Identification of new DR5 agonistic nanobodies and generation of multivalent nanobody constructs for cancer treatment.)

dimer뿐만 아니라 trimer tetramer등 사이즈를 증가시키는 연구도 있긴 하다는데, 굳이? Nb의 장점은 사이즈가 작다는 것인데 그럴필요가 있나싶다. 생략한다.

ELISA를 위한 tag를 달거나, GFP/RFP등을 달아서 어느 tissue에서 발견되는지, 남아있는지 등을 tracking하는 imaging 실험도 많이 행한다.

 

Therapeutic연구

Nbs를 단백질독성의 무언가와 linker를 통해서 연결해서 Nbs는 잡고, 단백질은 degradation되는 기작을 사용하는 연구가 있고 또는 Human IgG1의 hinge, Fc region을 달아서 자연스럽게 인간성 면역반응을 유도하거나 Half-life를 증가시키는 식의 연구도 한다고 한다. 

더 나아가, 나노바디(Nb)와 F-box, von Hippel–Lindau 단백질, 전사 활성화 도메인(transcription activation domains), DNA 결합 도메인(DNA binding domains) 등을 유전적으로 융합하여 세포 내에서 발현되는 다양한 정교한 Nb 기반 인트라바디(intrabody) 도구들을 개발하였다. 이러한 도구들을 활용하여 세포 내 단백질 표적을 특이적으로 분해하거나, 세포 발달 과정에서 유전자를 활성화하는 등의 연구를 진행함

F-box, von Hippel–Lindau 단백질이 나한테는 특히 중요한데 이 두 단백질 모두 단백질 분해(protease)를 유도하는 기작에 중요한 역할을 하는 단백질들이다. 자세한 내용은 나중에 결정하자. Nbs-linker-F-box또는 Nbs-linker-VHL등의 합성 단백질을 생산해서 실제 in vitro 실험을 해보는 전략이 가능할 것이다. 

그외 다양한 Nbs-tagged protein을 이용해서 다양한 생물학적 기능을 하는 새로운 합성 단백질을 생성하고 연구하는게 어렵기는 하지만, 몇몇 연구들이 진행되고 있다는 이야기를 죽 늘어놓고 있다. 내가 관심있는 분야는 target protein을 붙잡아서 degradation시키는 연구이니까 굳이 다른 이야기를 늘어놓지는 않아도 될 것 같다.

 

3.3. Enzyme-mediated conjugation

효소 연관 Nbs연구인데 나는 효소랑 연계하는 건 관심없다. 생략

3.4. Chemical crosslinking

화학적인 방법을 이용해서 Nbs를 연결하는 방법들도 있다는데, 내가 관심있는 연구는 아니다. 생략

 

4. Applications where nanobodies make the difference

4.1. Nanobodies as research tool

워낙 크기가 작으니까 단백질의 3D 구조결정화 실험을 통해서 단백질의 구조를 밝혀내는데 큰 도움이 되었다는 내용이 있는데 나는 구조생물학은 관심 없으니까 이부분은 딱 요정도로 생략. Electromicroscopy에서 확인하기 위한 compound를 Nbs에 달아놓고 target 단백질에 덕지덕지 붙여두면 표면 파악이 가능하지않나? 그런 연구이지 않을까 정도로 이해하고 넘어감

반면, 특정 단백질이나 효소의 knockout을 유도하는 연구들은 약간 흥미가 있는데, 뭐 크게 언급할건 없다. 당연히 목표로 하는 단백질에 달라붙어서 activation site를 제한하거나 allosteric agent로 작용해서 단백질 활성을 조절하거나 knockout하는 식의 연구가 가능하다고 한다. 

또는 뭐 아까 말한 chromobody나 GFP, RFP를 tagging해서 tracking연구를 하는 방향등의 reserach tool로 사용된다고 한다.

 

4.2. Nanobodies in diagnostic applications

in vitro 및 in vivo 모두에서 이 분야에서 엄청나게 잘 사용되고 있는데 특히 HER2에 대한 Nbs관련의 진단 시약이 현재 clinical trial phase I을 지나고 있는것이 있다고 한다. 그리고 뭐 CT/ PET등에 사용되는 경우도 많다고 한다.

 

4.3. Nanobodies in therapy

Caplacizumab이 최초로 FDA승인을 받은 Nbs 기반의 치료제, 그외에도 많긴 한데 imunogenicity를 고려하여 연구하였음에도 불구하고 clinical trial 단계에서 autoimmune disease를 유발하는 경우가 많다고 한다.

몇몇 dimerization을 해서 만든 Nbs들은 보통 하나는 Albumin을 targeting 하도록해서 half-life를 증가시키는 경우가 많은데 이러면 혈액에서도 오래 남아있다는 장점을 갖게되지만 반대로 사이즈가 커져서 tissue penetrating 능력이 감소하거나 extravasation (혈액에서 조직으로 분출되는 능력) 능력이 현저히 감소되어 원하는 tissue로의 전달능력이 감소된다.

또 그렇다고 target만 interaction하는 monomer를 사용하면 tissue 자체에 전달되는 것은 쉽겠으나 사이즈가 너무작아서 blood 내에서 kidney로 이동되는순간 바로 filteration되어서 제거되므로 half-life가 너무 짧아져 원하는 tissue로 축적시키기가 어려워진다는 단점이 있단다.

Nb-based CAR-T 연구가 최근에 많이 이뤄지고 있나보다. CAR-T 치료제는 T-cell의 표면에 target Ag에 직접 결합할 수 있는 receptor를 달아놓아서 T-cell이 직접 그 Ag를 인지하게되고 kill하게 되는 치료제인데, 그 receptor를 Nb-based로 합성해서 T-cell 표면에서 발현시키면 Nbs가 target Ag를 인지하는 식의 치료제라고 한다. 이 치료제들은 최근까지도 연구가 계속 되고 있어보이고 치료제 시장도 나름 규모가 있는 편 같아서 조금 살펴볼 의미가 있어 보여 ref들을 정리해놓는다. 순서대로 IF 7, 12, 9점대 논문으로 수준도 높은 저널이다.

• A novel nanobodybased target module for retargeting of T lymphocytes to EGFR-expressing cancer cells via the modular UniCAR platform
• From mono- to bivalent: improving theranostic properties of target modules for redirection of UniCAR T cells against EGFRexpressing tumor cells in vitro and in vivo
• Nanobody-based CAR T cells that target the tumor microenvironment inhibit the growth of solid tumors in immunocompetent mice

 

5. Perspective

해당 부분은 ChatGPT를 이용해서 요약한다.

1. 나노바디 라이브러리의 잠재력

• Naïve 및 Synthetic Nb Libraries:
  • Naïve(비면역) 및 Synthetic(합성) 나노바디 라이브러리는 면역화가 어려운 표적이나 특정 항원 표면의 모든 에피토프를 대상으로 하기 위한 강력한 도구로 제안됩니다.
  • 특히, 합성 라이브러리는 면역 반응 없이 고도로 다양한 Nb를 생성할 수 있습니다.
• Immune Nb Libraries:
  • 단백질 표적에 대한 면역 나노바디 라이브러리는 표적에 대한 높은 친화도를 가지며, 에피토프 갭(epitope gap)이 존재할 가능성이 있음에도 효과적입니다.
  • 면역화 동안 B 세포의 증식으로 인해 더 높은 친화도로 성숙된 HCAbs(Heavy Chain Antibodies)와 나노바디가 생성됩니다.
  • 이는 표적 발견 및 기능적 검사를 위한 전략으로 활용될 가능성이 높습니다.

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2. 진단에서 나노바디의 활용

• 나노바디는 진단 키트와 같은 다양한 응용 분야에서 강력한 도구로 사용될 가능성이 높습니다.
  • 장점:
    • 고온, 화학적 변성제와 같은 극한 조건에서도 내구성이 우수.
    • 작은 크기와 높은 밀도의 타겟 탐지 기능.
    • 비특이적 흡착을 최소화하여 민감도를 증가.
  • 응용 분야:
    • 저비용 진단 키트(Lateral Flow Assay, LFA).
    • 전기화학적 탐지 시스템.
    • 비침습적 체내 영상(In Vivo Imaging):
      • Nbs는 빠르게 조직에 확산하고, 불필요한 물질은 신장에서 제거됨으로써 이상 조직을 추적하는 데 적합합니다.

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3. 치료에서 나노바디의 역할

• 나노바디는 미래의 치료법 중심에서 중요한 역할을 할 것입니다.
  • 독립적 치료제:
    • Nb를 정맥 주입하거나 약물, 방사성 동위원소와 결합하여 빠르게 조직에 침투.
  • 체류 시간 증가 전략:
    • Nb를 혈청 알부민(또는 다른 혈청 단백질)과 융합하여 체내에서 체류 시간을 늘리는 전략이 고려됩니다.
    • 이는 깊은 조직 침투 속도를 감소시킬 수 있지만, 전체적인 Nb 농도를 높이는 데 기여.
  • 맞춤형 설계:
    • 특정 질병 유형에 따라 단량체 Nb, TRNT Nb, 다중특이성 Nb(BiTE) 등이 설계됩니다.